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分子生物學技術的又一次進階

更新時間:2018-05-03點擊次數:3523

Nature報道了一項新的技術——新型核糖體,通過控制細胞合成蛋白質的過程,讓人們更好地理解蛋白質的合成過程。

核糖體是一種細胞器,細胞利用核糖體轉錄mRNA的信息,從而將氨基酸翻譯成蛋白質。試想,如果核糖體被改造,將會發(fā)生什么?伊利諾斯大學生化學家AlexanderMankin與西北大學生化學家Michel Jewett 聯手制造出新型核糖體,并且這種核糖體zui大的優(yōu)勢在于可以根據需要改變其原有的工作方式。

每個核糖體都是大、小兩個亞基組成的不規(guī)則顆粒,不同的大小亞基有多種結合方式,其可變性也很高。兩位學者根據這種大小亞基結合的多變性,通過RNA將大小亞基連接。經過長時間的研究發(fā)現,這種通過RNA將大小亞基結合的結構可以在細胞內穩(wěn)定存在數月,并且這種核糖體亞基能夠維持細菌緩慢生長,證明這種合成的核糖體亞基與天然的核糖體可并行發(fā)揮作用。

這一發(fā)現開啟了分子生物學的新紀元,在未來或許可以制造出新型的抗生素。

 

WesternBlot操作

1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 
      使用適當的裂解液裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白,例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進行抽提。

需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度??梢允褂肂CA蛋白濃度測定試劑盒。
2. 電泳(Electrophoresis) 
(1) SDS-PAGE凝膠配制 
      SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制,也可以使用 SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。 
(2) 樣品處理 
      在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。92℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。 
(3) 上樣與電泳 
     冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。  
     電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設置在80-100V,高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求為了電泳方便起見,也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式,通常把電壓設置在100V,然后設定定時時間為90-120分鐘。設置定時可以避免經常發(fā)生的電泳過頭。
     通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況,預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。
3. 轉膜(Transfer) 
     我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP36/FFP39)硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。 
     通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置,可以設定轉膜電流為300-400mA,轉膜時間為30-60分鐘。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉膜時間越短。
     在轉膜過程中,特別是高電流快速轉膜時,通常會有非常嚴重的發(fā)熱現象,把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。 
     轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準,通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色,以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色,以觀察蛋白的殘留情況。 
4. 封閉(Blocking) 
     轉膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產生較高的背景。 
     加入Western封閉液,在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體,可以4封閉過夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 
     參考一抗的說明書,按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。 
洗凈封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以4緩慢搖動孵育過夜?;蚋鼡贵w的說明選擇適當的孵育溫度和時間。
     回收一抗。加入Western洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。洗凈洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。 
 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 
     參考二抗的說明書,按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋熒光標記的二抗。 二抗需根據一抗進行選擇,例如,一抗是小鼠來源的IgG,則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗,如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)。洗凈洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 
     回收二抗。加入Western洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

7、熒光顯微鏡下觀察熒光

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