一般流程

1.用聚乙烯亞胺或多聚賴氨酸涂覆蓋玻片，在室溫下放置 1 小時(shí)。

2. 用無菌水充分漂洗蓋玻片3 次，每次1 小時(shí)。

3. 充分干燥蓋玻片，在紫外光下滅菌少4 小時(shí)。

4. 使細(xì)胞在玻璃蓋玻片上生長。

5. 用磷酸鹽緩沖液(PBS) 簡單漂洗。 推薦使用1 × PBS 0.1% Tween 20 作為洗滌緩沖液。

固定 

可使用以下兩種方法中的一種固定細(xì)胞： 

1.室溫下，在100% 甲醇（-20 ℃ 冷凍）中孵育細(xì)胞5 分鐘。

2. 室溫下，在4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中，pH 7.4）中孵育細(xì)胞 10 分鐘。 用冰PBS 洗滌細(xì)胞3 次。 

抗原修復(fù)（可選步驟） 

在抗原修復(fù)緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加熱處理后，有些抗體的效果會(huì)更好。查看產(chǎn)品信息，了解每種一抗的使用建議。

1. 將抗原修復(fù)緩沖液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）預(yù)熱 95 ℃。具體方法為：將裝有緩沖液的蓋玻片染色缸置于水浴鍋中，水浴鍋的溫度設(shè) 為 95 ℃。

2. 用小型寬頭鑷子小心將蓋玻片置于蓋玻片染色缸內(nèi)的抗原修復(fù)緩沖液中，記下長 有細(xì)胞的蓋玻片面。 

3. 在 95 ℃ 下加熱蓋玻片10 分鐘。 

4. 從抗原修復(fù)緩沖液中取出蓋玻片，浸入 6 孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的PBS 溶液中，保持 長有細(xì)胞的一面朝上。 

5. 用 PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。 

通透 

1.如果靶蛋白位于細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理尤為關(guān)鍵。用甲醇固定的樣品不需要進(jìn)行 通透處理。 用PBS（含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin）孵育樣品10 分鐘。Triton X-100 是用于提高抗體滲透性*常用的 去垢劑。但 Triton X-100 會(huì)破壞細(xì)胞膜，因此不適用于細(xì)胞膜抗原。

2.確定每種目標(biāo)蛋白的Triton X-100 佳比例。

3.用 PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。 

封閉與免疫染色 

1.用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細(xì) 胞30 分鐘，封閉抗體的非特異性結(jié)合（可替代的封閉液包括 1% 明膠或來源于產(chǎn)生 二抗的物種的10% 血清：查看抗體數(shù)據(jù)表了解相關(guān)建議）。

2.室溫下，用稀釋抗體（溶于 1% BSA 的PBST 中）在濕盒中孵育細(xì)胞1 小時(shí)， 或4 ℃ 過夜孵育。倒出溶液，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。

3.室溫下，用二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細(xì)胞1 小時(shí)。

4.倒出二抗溶液，用PBS 避光洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。

多色染色（可選步驟）

要檢測同一個(gè)樣品中兩種或多種抗原的共同分布情況，需要使用雙重免疫熒光流程。該流程可在混合物中同時(shí)進(jìn)行檢測，也可逐個(gè)抗原依次進(jìn)行檢測。 

確保抗體來源于不同物種并且這些抗體有相應(yīng)的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗體和抗抗 原B 的鼠抗體。也可使用偶聯(lián)不同熒光團(tuán)的直標(biāo)一抗。

同時(shí)孵育

1. 用封閉液孵育細(xì)胞30 分鐘。

2. 室溫下，用兩種一抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）在濕盒中孵育細(xì)胞1 小 時(shí)，或4 ℃ 過夜孵育。

3. 倒出溶液，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。

4. 室溫下，用兩種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細(xì)胞1 小時(shí)。

5. 倒出二抗溶液，用PBS 避光洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。

依次孵育 

1. 第一封閉步驟：室溫下，用第一封閉液（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血 清）孵育細(xì)胞 30 分鐘。

2. 室溫下，用第一種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在濕盒中孵 育細(xì)胞1 小時(shí)，或4 ℃ 過夜孵育（一抗溶于 1% 明膠或 1% BSA 的PBST 中）。

3. 倒出第一種一抗溶液，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。

4. 室溫下，用第一種二抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）避光孵育細(xì)胞1 小時(shí)。

5. 倒出第一種二抗溶液，用PBS 避光洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。

6. 第二封閉步驟：室溫下，用第二種血清（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血 清）避光孵育細(xì)胞30 分鐘。

7. 室溫下，用第二種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在濕盒中避 光孵育細(xì)胞1 小時(shí)，或4 ℃ 過夜孵育。

8. 倒出第二種一抗溶液，用PBS 避光洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。

9. 室溫下，用第二種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細(xì)胞1 小時(shí)。

倒出第二種二抗溶液，用PBS 避光洗滌細(xì)胞3 次，每次5 分鐘。 

如需檢測兩種以上的抗原，其余抗體按照步驟1–5 繼續(xù)操作

復(fù)染 

1.用 0.1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI（DNA 染色）孵育細(xì)胞 1 分鐘。

2. 用 PBS 漂洗細(xì)胞。

封片 

1. 用一滴封片介質(zhì)封閉蓋玻片。 

2. 用指甲油密封蓋玻片，避免樣品變干和在顯微鏡下移動(dòng)。 

3. -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存。