四正柏凋亡檢測試劑盒說明書

相關介紹:細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨te的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用Annexin V與PI雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。

儲存條件:2-8℃避光保存,勿冰凍。

有 效 期：一年

注意事項:本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。此產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床診斷。

操作步驟：

1. 細胞樣品的準備：

   a)對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內備用。用不含EDTA的胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完quan離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。

   b)對于懸浮細胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完quan離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。

2. 用去離子水按1:3稀釋結合緩沖液(4ml 4x結合緩沖液+12ml去離子水)；

3. 用1x結合緩沖液重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為1-5×106/ml；

4. 取100µl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5分鐘；

5. 加入10µl 20ug/ml的碘化丙錠溶液(PI)，并加400µl PBS，立刻進行流式檢測。

實驗設計：

空白管：陰性對照組細胞，不加Annexin V/FITC，碘化丙錠溶液(PI)。用于調節(jié)電壓單染管：陽性對照組細胞，只加Annexin V/FITC。用于調節(jié)補償

檢測管：處理的細胞，加 Annexin V/FITC，碘化丙錠溶液(PI)。用空白管和單染管調節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

樣本分析：

1. 流式細胞儀分析：FITC 的最大激發(fā)波長是 488nm，最大發(fā)射波長是 525nm，建議選擇FL1 通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發(fā)波長是 535nm，最大發(fā)射波長為 615nm，PI 的紅色熒光在 FL2 或 FL3 通道檢測。用FlowJo等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC 為橫坐標，PI 為縱坐標。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡或壞死的細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

2. 熒光顯微鏡觀察：

a)滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。

b)在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色，PI 熒光信號呈紅色。

【注】：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡。

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