Elabscience®自主研發(fā)的 Caspase 1 Activity Assay Kit 采用分光光度法，可用于檢測(cè)細(xì)胞、組織裂解液或其它樣本的caspase 1 活性。那么你知道Elabscience Caspase 1活性檢測(cè)試劑盒該怎么用嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、準(zhǔn)備工作

1. Cell Lysis Buffer 溶解后混勻，冰浴備用。

2. 2×Reaction Buffer 溶解后混勻，冰浴備用。

3. Ac-YVAD-pNA 和 pNA 溶解后混勻，冰浴備用。

二、樣本準(zhǔn)備

1. 細(xì)胞樣本

按照常規(guī)方法收集細(xì)胞沉淀，PBS 重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，600×g離心 5 min，棄上清，按照每 100 萬(wàn)細(xì)胞加入 100 μL Cell Lysis Buffer 的比例加入預(yù)冷的 Cell Lysis Buffer 重懸細(xì)胞，在冰浴條件下裂解 30 min，裂解期間需渦旋震蕩 3~4 次，每次 10 s。裂解后的樣本，于 4°C，11000 ×g 離心 10~15 min，小心地吸取上清至新的 EP 管中，并置于冰上待用。同時(shí)使用 Bradford 法（E-BC-K168-M）測(cè)定蛋白濃度。

2. 組織樣本

取50 mg待測(cè)組織樣本，用PBS或者生理鹽水清洗1-2次，去除組織中殘留的血細(xì)胞，用手術(shù)剪剪碎，加入200μL 預(yù)冷的Cell Lysis Buffer，進(jìn)行勻漿（在冰浴條件下進(jìn)行，若組織質(zhì)量加倍時(shí)，加入的預(yù)冷Cell Lysis Buffer 也需加倍）。將勻漿好的樣本轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，冰浴裂解30min。裂解后的樣本，于 4°C，11000×g離心10~15min，小心地吸取上清至新的EP管中，并置于冰上待用。同時(shí)使用 Bradford法（E-BC-K168-M）測(cè)定蛋白濃度。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 制備 pNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（選做）

1) 配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：取冰浴的 Cell Lysis Buffer 和2×Reaction Buffer，按照 1:1 配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，渦旋或吹打混勻。

2) 進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)喝?支EP管，第一支EP管中加入294 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，其他每管中加入150 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，從pNA (10 mM)的標(biāo)準(zhǔn)品中吸取6 μL到第一支 EP管中混勻配成 200 µM 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，吸取150 μL 到第2支EP管，混勻后吸取150 μL到第3支EP管，按此步驟往后依次吸取混勻至第5支EP管，如下圖所示：

3) 每管取100 µL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品置于酶標(biāo)板或比色皿中，檢測(cè)405 nm下 OD值。（為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品都設(shè)立復(fù)孔。）

4) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：分別以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)絕對(duì)OD值（每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的 OD405減去不含pNA的OD405）作為x軸和y軸，使用圖形軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如下圖所示。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

2. Caspase 1 的活性檢測(cè)

1) 取 50 μL 樣本裂解液，按照下表設(shè)置反應(yīng)體系。

2) 加入 Ac-YVAD-pNA 后混勻，37°C 孵育 1~2 h，發(fā)現(xiàn)顏色變化較明顯時(shí)即可檢測(cè) OD405。若顏色變化不明顯，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間到 4 h。

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