EZBioscience^® 2× Color SYBR Green qPCR 預(yù)混液 （ROX2 plus） 使用經(jīng)過特殊修飾的 Taq DNA 聚合酶，該聚合酶受熱啟動(dòng)保護(hù)活化技術(shù)和優(yōu)化的qPCR緩沖液系統(tǒng)，以進(jìn)行基于SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）。該混合物補(bǔ)充了惰性紅色染料。以及 EZBioscience^® 彩色逆轉(zhuǎn)錄試劑盒含有惰性藍(lán)色染料，以避免移液錯(cuò)誤。在qPCR反應(yīng)中將cDNA和其他組分混合在一起，使溶液變成紫色。這在移液時(shí)提供了視覺幫助，并降低了反應(yīng)設(shè)置過程中移液錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是在使用白色反應(yīng)容器時(shí)。染料不影響qPCR反應(yīng)的特異性或靈敏度。該混合物以 2× 的反應(yīng)濃度制備，可直接用于高模板和低模板 qPCR，具有高靈敏度、特異性和可靠性。

常見問題及解決方法：

1. 陰性對照組可觀察到明顯擴(kuò)增

原因：使用的試劑或水被污染、引物二聚體的外觀

解決方法：更換新試劑或水并重試。反應(yīng)應(yīng)在超凈臺架上進(jìn)行，以盡量減少空氣污染、在35個(gè)周期后，陰性E對照組出現(xiàn)擴(kuò)增是正常的可以結(jié)合熔融曲線進(jìn)行分析

2. ct值出現(xiàn)太晚(大)

原因：放大效率低、模板的濃度太低、模板退化、擴(kuò)增子太長、反應(yīng)中存在PCR抑制劑

解決方法：優(yōu)化反應(yīng)，嘗試三步程序或重新設(shè)計(jì)引物、增加模板量，同時(shí)避免破壞擴(kuò)增效果、準(zhǔn)備新的模板，然后重試、擴(kuò)增子的長度建議在100bp~200 bp之間、添加模板時(shí)通常會引入抑制劑，增加稀釋倍數(shù)或準(zhǔn)備新模板并重試。

3. 擴(kuò)增曲線形狀異常

原因：擴(kuò)增曲線粗略、曲線斷裂、曲線突然下降

解決方法：信號弱而引起的系統(tǒng)整流，升高模板濃度并重復(fù)反應(yīng)、模板的濃度太高，基線的結(jié)束值大于Ct值，減少基線的末端(Ct值-4)，并重新分析數(shù)據(jù)、反應(yīng)管中存在氣泡，當(dāng)溫度升高時(shí)，氣泡破裂，從而儀器檢測到熒光值的突然降低，快速旋轉(zhuǎn)，仔細(xì)檢查反應(yīng)前是否有氣泡。

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