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賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書及操作指南

更新時(shí)間:2025-03-25點(diǎn)擊次數(shù):2042

賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào)11668019)說明書及操作指南

一、產(chǎn)品概述

Lipofectamine 2000是賽默飛世爾研發(fā)的高效陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNAsiRNACRISPR組件遞送。其采用脂質(zhì)納米顆粒技術(shù),在保證轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)顯著降低細(xì)胞毒性,被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、RNA干擾及基因編輯研究。

二、核心參數(shù)

· 貨號(hào)11668019

· 包裝規(guī)格0.75 mL / 1.5 mL

· 適配樣本DNA(質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物)、RNAsiRNA/miRNA/lncRNA

· 推薦細(xì)胞類型HEK293、HeLa、CHO、原代細(xì)胞等

· 儲(chǔ)存條件4℃避光保存(嚴(yán)禁凍存

· 有效期:未開封12個(gè)月,開封后6個(gè)月

三、標(biāo)準(zhǔn)操作流程(以6孔板為例)

1. 試劑配制

稀釋液選擇Opti-MEM®(貨號(hào)31985070)或同類型無血清培養(yǎng)基

DNA稀釋:每孔2-4 μg DNA,用250 μL稀釋液混勻

脂質(zhì)體稀釋:按DNA用量1:2.5比例稀釋(如2 μg DNA5 μL Lipofectamine 2000

2. 復(fù)合物制備

DNA與脂質(zhì)體稀釋液等體積混合

室溫靜置15-20分鐘,形成乳白色復(fù)合物(顯微鏡下可見均勻納米顆粒)

3. 細(xì)胞處理

轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度:70%-80%融合

移除原培養(yǎng)基,加入1 mL含復(fù)合物的新鮮培養(yǎng)基

37℃培養(yǎng)4-6小時(shí)后換液

四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞狀態(tài)要求

優(yōu)先選用低傳代細(xì)胞(P5-P10),原代細(xì)胞建議預(yù)鋪ECM基質(zhì)(如Matrigel®

2. 血清干擾機(jī)制

DNA轉(zhuǎn)染可保留≤10%血清,RNA轉(zhuǎn)染需全程無血清(避免核酸酶降解)

3. 毒性控制

貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間≤6小時(shí)(超時(shí)存活率下降20%-30%

懸浮細(xì)胞建議采用分步換液法

五、跨場(chǎng)景應(yīng)用案例

1. CRISPR/Cas9基因編輯體系構(gòu)建

質(zhì)粒配比:Cas9質(zhì)粒(1 μg: sgRNA1.5 μg

共轉(zhuǎn)染支持:可同步遞送熒光報(bào)告質(zhì)粒(如pmCherry-C1

效率驗(yàn)證:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后Western Blot檢測(cè)靶蛋白敲除效果(編輯效率≥80%

2. siRNA沉默實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

siRNA工作濃度:20-50 nM

復(fù)合物靜置時(shí)間:嚴(yán)格控制在20分鐘內(nèi)(超時(shí)導(dǎo)致效率衰減≥15%

結(jié)果檢測(cè):qPCR驗(yàn)證mRNA水平(建議設(shè)置GAPDH內(nèi)參對(duì)照)

六、技術(shù)問題排查指南

問題現(xiàn)象

可能原因

解決方案

轉(zhuǎn)染效率<50%

DNA純度不足(OD260/280異常)

使用酚氯法重新純化DNA

細(xì)胞死亡>30%

脂質(zhì)體過量或轉(zhuǎn)染時(shí)間過長

降低脂質(zhì)體比例至1:1.5,縮短轉(zhuǎn)染至4小時(shí)

熒光信號(hào)不均勻

復(fù)合物沉淀

轉(zhuǎn)染前渦旋混合液10

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