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免疫細(xì)胞(ICC)實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些?

更新時(shí)間:2023-10-20點(diǎn)擊次數(shù):1506

免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC) 是一種使用熒光抗體或染料來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)靶抗原的技術(shù)。那么免疫細(xì)胞(ICC)實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些?讓我們一起來(lái)看看吧!

一、熒光信號(hào)弱

1. 樣品質(zhì)量

選用新鮮制備的樣本以及適當(dāng)?shù)谋3謼l件。

2. 靶標(biāo)豐度低

適當(dāng)提高一抗?jié)舛取?/span>

選擇熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的二抗。

3. 固定方法不當(dāng)

甲醛和蛋白的氨基通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合,可能會(huì)遮蓋抗原表位,導(dǎo)致靶表位信號(hào)減弱。建議調(diào)整抗原修復(fù)方法或固定方法。

多聚甲醛會(huì)與GFP熒光蛋白發(fā)生醛化反應(yīng),導(dǎo)致信號(hào)減弱。

檢測(cè)膜蛋白一般不建議使用甲醇或丙酮固定,有機(jī)溶劑能夠破壞膜結(jié)構(gòu)。

4. 透化方法不當(dāng)

檢查靶標(biāo)蛋白表達(dá)位置,胞內(nèi)蛋白需要透化處理。

膜蛋白需要考慮所檢測(cè)靶表位位于膜內(nèi)還是膜外,膜外則不需要透化。

5. 信號(hào)放大不夠

如果檢測(cè)靶點(diǎn)是低豐度蛋白.信號(hào)弱可能是由于信號(hào)放大不足導(dǎo)致的,可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信號(hào)放大技術(shù),進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào),實(shí)現(xiàn)低豐度,難以檢測(cè)蛋白的檢測(cè)。

二、背景太高

1. 封閉不足

1)選用二抗種屬來(lái)源的血清封閉。

2)選用鏈霉親和素/生物素系統(tǒng),需要用鏈霉親和素封閉內(nèi)源的生物鏈酶。

3)選用HRP系統(tǒng),需要使用過(guò)氧化氫等商業(yè)化試劑盒去活化內(nèi)源性HRP。

4)選用AP系統(tǒng),需要使用左旋咪唑等商業(yè)化試劑去活化內(nèi)源性磷酸酶。

2. 一抗

一抗?jié)舛冗^(guò)高,減少用量

3. 二抗

1)設(shè)置無(wú)一抗對(duì)照,幫助確認(rèn)背景是否來(lái)源二抗。

2)二抗?jié)舛冗^(guò)高,減少用量。

3)抗體凝聚,使用二抗前離心去掉抗體凝聚物。

4)使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗,信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。

4. 自發(fā)熒光

1)設(shè)置自發(fā)熒光對(duì)照,確定是否自發(fā)熒光。

2)固定劑如醛類和氨基共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致的自發(fā)熒光,可用硼氫化na去除。

3)增加固定劑的漂洗次數(shù)。

4)避開(kāi)背景高的波段,選用背景較低的波段檢測(cè)。

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